大战绿妖之后，蜘蛛侠帕克忍痛拒绝了他唯一的挚爱玛丽，因为蜘蛛侠的身份会为自己和亲人带来巨大危险，帕克决定独立承担起蜘蛛侠的责任。帕克一直在忙于应付各种挑战：学习超能力的灵活运用；在超级英雄与平凡大学生的双重身份下隐藏自我、小心翼翼地生活等等。

故事发生在第1集结束2年后，彼得·帕克继续过着自己的双重生活，平时是性情温和的大学生，晚上则化身为拥有超能力的英雄蜘蛛侠，可是这两者之间的微妙平衡却越来越难以维系，爱人、朋友和慈爱的阿姨都开始怀疑他的真实身份；同时他还多了个更可怕的敌人——章鱼博士，彼得·帕克必须用尽全力对付这位邪恶魔头的疯狂计划。